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病毒采集出新招,围观方法秘籍-赛多利斯实验室

[2019/4/3]

引 言
根据采集经空气传播细菌的经验(Petras 1966,1967;Rotter和Koller 1974),测试比较了凝胶过滤器以及撞击采样器和标准撞击器(AGI-30型)对病毒气溶胶进行采样的有效性。
这些研究有两大目标:
制定过滤病毒气溶胶和处理用于采集病毒气溶胶的过滤器的标准方法
测试过滤器是否适合大容量采样
 
材料和方法

研究
采用实验产生的大肠杆菌噬菌体静态气溶胶(在宽湿度范围内具有高稳定性)、T3大肠杆菌噬菌体和A/PR/8/34(H1N1)流感病毒。气溶胶是在温度和相对湿度可调节的50 m3的实验室中使用具有导液器(粒径≤5μm)的喷射雾化器制成的。气溶胶使用安装在16711采集器(Collectron,MD8 airscan空气采样器之前的型号)架中的12602凝胶过滤膜过滤。在高流量下,该装置可与两台并联的真空泵互换使用(目前的Sartorius MD8 airscan空气采样器专为高流量设计)。

标准操作程序和采样体积由应用于撞击采集器和AGI-30撞击器的采样器工作原理确定。

通过琼脂覆盖法(噬斑法)对收集的噬菌体颗粒进行定量测定,使用孵育蛋滴定流感病毒(Mayr等人,1974,1977)或通过在腹水肿瘤细胞培养后进行血吸附测试(Adamczyk等人,1975)。

 
结果

一、通过空气过滤和过滤器处理对病毒气溶胶进行取样的标准程序(T1和流感病毒气溶胶的结果)
过滤器的0.1-0.4 m/s入口速度不影响过滤器在每升空气中的感染单位(I.U.)产率。因此,当采集稳定性未知的病毒时,建议采样时间为1-2min,入口速度为22.5 l/min或0.3 m/s。在此过程中,不受高达85%的相对湿度影响的过滤器显示99.9%或更高的高截留率。
 
通过在琼脂平板上直接培养凝胶过滤器来确定空气传播细菌数量这一常用方法对病毒气溶胶是不可行。对于病毒气溶胶,较切实可行的方法是将过滤器溶解于合适的介质中,然后使用实验室振动器将介质充分混合以分解任何微生物|病毒聚集。
 
以下程序已证明是有效的。为了溶解过滤器,在200ml宽颈锥形烧瓶中放入20 ml pH值为7.2的m/15磷酸盐缓冲液和40个直径为2.5 mm的玻璃珠。将烧瓶置于调节至适当速度的实验室振动器上,在室温下摇动溶液5分钟。缓冲溶液的体积可以减少到2.5 ml,以便浓缩感染颗粒。在此过程中,过滤器完全溶解。

二、使用凝胶过滤器、撞击采集器和撞击器根据标准程序比较采样T1和T3气溶胶
对于两种噬菌体气溶胶,3种采集方法的效率顺序为νF>νI-C>νI(图1),这有利于过滤器。这种差异产生了其有效性的比例。对于T3气溶胶,νF:νI-C:νI为4.02:3.76:1,其中过滤器和撞击采集器之间的差异不显著。对于T1气溶胶,比例为2.04:1,44:1(50%相对湿度);各值之间1%的差异具有重要意义。在气溶胶浓度108-105个噬菌体颗粒/m3空气的范围内确认了采集效率的顺序,这也是使用标准程序的所有3种采集方法对噬菌体气溶胶的下检测限。

图1  AGI-30撞击器(I)、凝胶过滤器(F)和撞击采集器(I–C)间对T1和T3气溶胶采集效率的比较。

三、用凝胶膜过滤器大体积取样病毒气溶胶
作为检测低病毒颗粒(病毒粒子)浓度的先决条件,大体积量取样在理论上可以通过以下方式实现:
在特定时间内增加流量
延长采样时间

1.延长采样时间(T1和甲型流感病毒的结果):
通过过滤器以0.3 m/s的入口速度对空气采样15分钟(相当于337.5升采样空气),不会导致采集的病毒粒子失活。该试验的取样程序通过减少缓冲溶液体积以获得更高的病毒粒子|噬菌体粒子浓度,证明了较低的检测限可以低转换为102 I.U./m3空气范围(图2)这一数学理论。

图2  用于产生气溶胶的每毫升液体中噬菌体颗粒的浓度与使用凝胶过滤器采集产生的每升空气中l.U.的数量之间的关系。在相对湿度为50-55%和20℃下的T1气溶胶。
A-E表示采集条件:
A      标准程序(参见一般信息)
B      取样时间:  5 min,  溶液体积:20   ml
C      取样时间:15 min,  溶液体积:20   ml
D      取样时间:  5 min,  溶液体积:  5   ml
E      取样时间: 15 min, 溶液体积:  5   ml  

2.以更高的流速对病毒气溶胶采样:
以更高的入口速度(高达1.8 m/s,相当于135 l/min)和极端环境条件(最高30°C,相对湿度为90%)在凝胶过滤器上进行的机械应力测试帮助我们在采样期间在这些更恶劣的条件下测试病毒气溶胶的稳定性。
 
令人惊讶的是,入口速度能够增加至1.6 m/s,而不会对过滤器的效率产生显著影响。对于T1气溶胶,与用作参考量的标准AGI-30撞击器相比,过滤器的产率为140%(图3)。在入口速度为1.8 m/s时,产率下降至撞击器的107%。
 
通过计算气流的雷诺数,可以根据由空气湍流引起的采样过程产生的物流干扰追踪产率下降的原因。即使在15分钟的采样时间内,T1大肠杆菌噬菌体和甲型流感病毒(图4)都显示出较高的稳定性。


图3  在20℃和相对湿度为55%的情况下对T1气溶胶取样后的凝胶过滤器的产率作为过滤器入口速度的函数。


图4  凝胶过滤器采集流感病毒气溶胶的效率作为过滤器入口速度和采样时间的函数(6次试验)。

此外,对于T1大肠杆菌噬菌体,已经证实,即使在相对湿度为90%的情况下,过滤器的采集效率在恶劣的空气取样条件下依然保持恒定。值得注意的是,即使在极端应力下,过滤器对T1气溶胶的截留能力仍保持在99.82%的平均水平。在30℃和80-85%相对湿度下,在15分钟的采样时间内,经过测试的过滤器最大应力达到1.6 m/s的入口速度。对于T1气溶胶,过滤器的平均截留率为99.76%。
 
在这些条件下,过滤器的一致性、稳定性和处理性能发生明显改变。
 
过滤器的周边被浓缩水分的液滴湿润。虽然过滤器未粘附到过滤器支架底部且很容易除去,但出现了像橡胶一样的浓度变化。
 
扫描电子显微照片显示,在这些极端条件下,膜的网状壁结构膨胀到其正常直径的两倍或三倍。但是,过滤器的基本结构保持稳定。

 
评估总结

在成功使用凝胶过滤器采集经空气传播的细菌之后,现在也已证明凝胶过滤器适用于采集病毒气溶胶。
 
凝胶过滤器可为整个生物气溶胶(细菌、霉菌和病毒)系列提供可靠的采集方法。
 
使用过滤器进行采集的优点对病毒检测尤为重要,这些优点包括:
在宽流量/分钟范围内具有恒定的采集效率。
即使在温度和相对湿度的极端环境条件下,也能保持过滤器的高截留能力。
过滤器中的凝胶能起到像保护性病毒蛋白质衣壳一样的作用,保护病毒免受表面灭活影响。
使用凝胶过滤法不受病毒浓度影响。
该方法在采样之前的准备过程中以及之后的处理和评估期间需要的工作和材料都较少。
采集的病毒粒子可以在不同的细胞系上平行培养。

 
使用凝胶膜过滤法采集
病毒和噬菌体的一般信息

程序步骤
一、采集病毒和噬菌体:

带有凝胶过滤器的MD8 airscan空气采样器,一次性80 mmφ过滤器
* 此处给出的应用数据是使用具有50 mm凝胶过滤器的之前型号16711确定的
二、处理凝胶膜过滤器,将其溶解并在溶液中振动:

三、检测病毒和噬菌体:
四、通过储存使用过滤器来稳定截留的病毒气溶胶,一直储存至处理前: